Os moradores da Vila de São Paulo de Piratininga levavam uma vida muito diferente da dos moradores do litoral nordestino. Viviam simplesmente e, aos poucos, foram abandonando as tradições e costumes europeus devido à necessidade de se adaptar às condições específicas do ambiente.
Cultivavam pequenas roças de milho, de feijão e mandioca, fazendo com esta a chamada farinha-de-pau. Complementavam sua alimentação na floresta, onde buscavam carne, peixes e raízes. Suas casas eram feitas de taipa e cobertas de sapé. Desenvolveram um artesanato próprio, fabricando seus móveis e utensílios.
No entanto, aos poucos, foram ocupando as áreas vizinhas ao colégio dos Jesuítas. Nos sítios de roça começaram a plantar o trigo, que, além de ser usado para o próprio consumo, era exportado para o Rio de Janeiro, em cestos transportados pelos índios, que desciam a serra pela antiga trilha indígena.
Inventários fazem referência ao cultivo do algodão, da uva, da cana-de-açúcar e de árvores frutíferas. Os marmeleiros eram muito cultivados e a marmelada, exportada para outras capitanias. Desenvolveram a criação de suínos, carneiros e ovelhas. A escassez de moedas determinou a prática do escambo, variando de ano para ano as mercadorias utilizadas nas trocas: peles de animais, algodão, mel, cera, marmelada.
Os paulistas viviam lado a lado com o índio. A falta de mulher branca favoreceu a mestiçagem, com um intenso cruzamento entre os portugueses e as mulheres nativas, ocasionando o surgimento de mamelucos, legítimos ou bastardos. A população da Vila de São Paulo era, portanto, composta de brancos, mamelucos e índios. Assim, a língua portuguesa foi trocada pelo tupi, que predominou até o final do século XVIII. O tupi era a língua geral falada por todas as camadas sociais. Há registro de casos como o do inventário do senhor Brás Esteves Leme: o juiz de órfãos precisou de um intérprete para compreender as declarações de sua filha, Luzia Esteves, "por não saber falar bem a língua portuguesa". Também o bispo de Pernambuco levou um intérprete ao encontro que teve com o bandeirante Domingos Jorge Velho, em Palmares, "porque nem falar sabe".
Do século XVI ao XVIII, os apelidos usados pelos paulistas e os nomes dados aos acidentes topográficos por onde passavam eram quase todos de origem indígena: Anhangabaú, Butantã, Ibirapuera, Guarulhos, Itu, entre outros.
Ao isolamento econômico, provocado pela não integração aos mercados consumidores, juntou-se o isolamento ocasionado pelas condições geográficas. A presença da Serra do Mar dificultava o contato entre o litoral e o planalto, fazendo com que a Vila de São Paulo se tornasse refúgio de desertores, fugitivos da justiça e estrangeiros.
Tanto isolamento possibilitou aos paulistas desenvolver um sentido de autonomia, liberdade e até mesmo rebeldia frente às ordens metropolitanas. Exemplos desse tipo de comportamento aparecem no caso da proibição da captura de índios, como também no episódio lendário da Aclamação de Amador Bueno. Em 1641, com a notícia da Restauração Portuguesa, os paulistas teriam declarado sua independência, aclamando Amador Bueno como "rei de São Paulo". Entretanto, Amador Bueno recusou a perigosa homenagem e refugiou-se no Convento de São Bento até convencer os habitantes da vila a permanecerem fiéis ao novo rei português, D. João IV, o Restaurador.
Essa atitude de independência dos paulistas fez com que fossem chamados por um governador-geral de gente que "não conhece nem Deus, nem Lei, nem Justiça".
