De Gurupá partiu, em outubro de 1637, comandada por Pedro Teixeira, uma expedição oficial com o objetivo de explorar um rio dominado por mulheres cavaleiras e guerreiras – o Rio das Amazonas. Essa incursão, considerada por muitos como a maior façanha sertanista da região, contava com 47 grandes canoas, 70 soldados e 1.200 índios flecheiros. Observando a área, Teixeira buscou viabilizar o acesso à região peruana por via atlântica. Nesse trajeto, Belém seria a porta de entrada e, por isso mesmo, deveria ser muito bem guardada.
A expedição – composta, entre outros, pelo cronista Maurício de Heriarte e alguns religiosos importantes, como o capelão franciscano Agostinho das Chagas – subiu os rios Amazonas e Negro, onde deixou parte do grupo. Prosseguindo, alcançou Quito, em outubro de 1638. Pedro Teixeira tomava posse das terras em nome do rei de Portugal, embora este Reino ainda estivesse sob o domínio espanhol. Favorecidos pelas boas condições de navegação, aqueles homens aventureiros deparavam-se a todo instante com riquezas naturais da flora amazônica como o urucu, primeira especiaria a ser exportada para a Europa. Pousavam onde era possível, conduzidos por índios remeiros, montando acampamentos improvisados e navegando sempre nas mesmas horas do dia.
Já na viagem de volta, em uma das margens do Rio Napo, na confluência com o Rio Aguarico, Pedro Teixeira fundou o povoado da Franciscana (16 de agosto de 1639), que, conforme as instruções que constavam no seu Regimento, deveria servir "de baliza aos domínios das duas Coroas (de Espanha e Portugal)".
Essa expedição foi descrita no livro Novo Descobrimento do Grande Rio das Amazonas, editado em Madri em 1641. O governo espanhol mandou imediatamente recolher e destruir a publicação. Preocupava-se com a divulgação da rota para as minas peruanas e com as pretensões territoriais portuguesas relacionadas à sua colônia na América, sobretudo no momento da Restauração. Essa medida, entretanto, não impediu que, mais tarde, a expedição de Pedro Teixeira fosse usada pela Coroa lusitana para reivindicar a posse da Amazônia.
Vista por outro ângulo, essa incursão deu condições, pelo menos no que se refere à identificação do território, para a ocupação do vale amazônico, por meio da instalação de fortes e missões religiosas nas margens dos rios. No entanto, para o padre João Daniel, que ali já vivia, o verdadeiro "tesouro escondido" eram os nativos, cujas almas podiam ser convertidas.
Alguns capitães e sertanistas experientes, como Antônio Raposo Tavares, Manuel Coelho e Francisco de Melo Palheta, passaram a percorrer o Amazonas e seus afluentes descobrindo comunicações fluviais, atingindo aldeamentos espanhóis na região oriental da Bolívia e coletando sem cessar as especiarias, com ajuda dos nativos.
Os capitães sertanistas também estabeleceram algumas feitorias e postos de pesca. Combateram e foram combatidos por diversas tribos. Vencedores, escravizaram milhares de índios. As atividades desenvolvidas por eles, assim como por franciscanos, carmelitas, mercedários e jesuítas, foram importantes na expansão territorial, na conquista e na consolidação do domínio português.
